ag尊龙凯时细胞培养指南

培养条件

细胞培养条件包括DMEM培养基，10% FBS，1% P/S，适用于贴壁细胞。培养温度设定为37℃。在第一次传代时，建议使用1:2的比例进行传代。

传代注意事项

在细胞培养的过程中，建议同时购买多种培养基，以便享受优惠。在收到细胞后，需及时处理并培养至良好的状态。灌满完全培养液并封好瓶口是运输细胞的最佳方式。

消毒与培养

收到细胞后，首先用75%酒精喷洒整个细胞瓶，确保消毒后将其放置于超净台，进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃，5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以便稳定细胞状态后再进行后续处理。使用显微镜观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片（建议包含40x、100x及200x的图像），前三天的照片将作为重要的售后依据，未提供照片将默认细胞状态良好。

细胞传代步骤

贴壁细胞传代

若细胞未达到80%汇合度，需将培养液收集至离心管中，保留5ml的完全培养基后放入37℃，5% CO2的培养箱中继续培养；若细胞密度超过80%，可进行传代。具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁的PBS冲洗细胞1-2次。
2. 向培养瓶中加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，并在37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞的消化状态，若细胞变圆并脱落，迅速将其取出，轻敲培养瓶后加入5ml以上的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打使细胞完全脱落后吸出，并转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，去除上清液，补加1-2ml的完全培养基进行重悬。
4. 将细胞悬液按照1:2的比例分配到新T25瓶中，补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养。

悬浮细胞传代

有两种方法可以进行悬浮细胞的传代：

1. 半换液法：将培养瓶竖着放置于培养箱中静置1小时，轻轻吸出约3ml培养基，随后补充3ml的完全培养基。如培养基变色较慢，可直接添加约500ul的FBS。在传代过程中可直接补充5ml的新培养基，分成两个培养瓶进行培养。
2. 离心换液法：若需要分瓶，可以收集细胞悬液于离心管中，1000RPM离心5分钟，去除上清，补加1-2ml培养液后重悬均匀，按1:2的比例分入新T25瓶中，添加6-8ml的新完全培养基以维护细胞活力。后续传代应根据实际情况，按1:2至1:5的比例进行。

细胞冻存与复苏

细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖T25培养瓶的80%时，弃去培养基并用PBS清洗细胞一次；
2. 加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻观察，待细胞收缩并变圆后加入5ml完全培养基终止消化，轻轻吹打后将悬液转至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟；
3. 去除上清，加入1ml的无血清冻存液（如：货号C7001），混匀后转入冻存管中；
4. 将冻存细胞立即放入-80℃的冰箱，如需转入液氮罐中，建议在-80℃冰箱中存放超过24小时后再转入液氮。

细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管，并快速放入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟；
3. 去除上清后，加入5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37℃，5% CO2的细胞培养箱中；
4. 复苏后的第二天，应更换为新鲜的完全培养基继续培养。

注意事项

在运输过程中，某些细胞可能会因贴壁不牢而出现脱落，这是正常现象。如果脱落较多，可以将所有培养液收集至离心管，并在1000RPM下离心5分钟。收集上清用于过渡培养（以便做后期对比），沉淀可加入1-2ml胰酶，轻轻吹打、重悬并消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应。再进行离心，去除上清后，重悬于1-2ml完全培养基，然后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃，5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

通过遵循以上细致的步骤与注意事项，可以有效确保ag尊龙凯时细胞的培养、传代及复苏的成功，借此保持细胞的活性和稳定性。